生物胶粘剂已被应用于临床，是最具前景的伤口缝合和修复的缝合线和钉的替代品之一；然而，生物胶粘剂亟待解决的问题通常是对潮湿表面的附着力不足，机械强度不适当，止血效果差，细胞毒性等。
为了应对这些挑战，中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所戴建武研究员和陈艳艳研究员设计了一种基于胶原蛋白和淀粉材料(CoSt)的强力湿式组织粘合剂。CoSt水凝胶与贻贝、常青藤、牡蛎胶类似，具有排水、分子渗透、加强交联的特点，能快速去除界面水，增强韧性耗散，涉及多种可逆动力作用。因此，它们对受伤组织形成了强粘附和无缝线密封，并与组织液或血液直接接触，激发了健壮的生物界面，解决了缝线和商业上可获得的粘合剂的关键障碍。新型生物胶粘剂具有重复性强湿组织黏附性(62 ± 4.8 KPa)，高密封性能(153.2 ± 35.1 mm Hg)，自愈快，注射性好，形状适应性好。对于断尾、皮肤切口、严重肝脏、腹主动脉及神经横断损伤大鼠模型的不同止血需求，CoSt水凝胶止血效果优于纤维蛋白胶，原因是具有坚韧的伤口密封性能、出色的红细胞阻滞能力和激活止血屏障膜的协同功效。此外，对大鼠模型皮肤损伤修复的体内研究证实，CoSt水凝胶通过皮肤损伤/缺陷加速伤口愈合和功能恢复。该水凝胶湿粘性强、止血速度快、生物相容性好、对不规则靶位点的匹配性好、促进创面愈合效果好，是一种具有广阔应用前景的生物粘合剂。相关工作以“Biomimetic Natural Biopolymer-Based Wet-Tissue Adhesive for Tough Adhesion, Seamless Sealed, Emergency /Nonpressing Hemostasis, and Promoted Wound Healing”发表在《Advanced Functional Materials》。
图1. 仿生CoSt水凝胶的制备与形成
水凝胶的制备与表征
本研究开发了一种具有高韧性、强而持久的湿表面粘附性和良好止血能力的胶原淀粉基(CoSt)水凝胶。胶原蛋白和淀粉都是美国食品和药物管理局批准的生物材料，因为它们具有良好的生物相容性、降解性、组织再生能力和伤口愈合能力此外，它们可吸附血小板或刺激凝血因子的释放，与凝血因子相互作用，最终引起血小板聚集，具有良好的止血效果。胶原蛋白和淀粉分别是一种大分子蛋白质和多糖。胶原蛋白含有高浓度的阳离子氨基酸(如赖氨酸)，具有正电荷。在本研究中，研究者在胶原蛋白链(Col-da)上引入多巴胺基团来模拟贻贝蛋白质的粘附机制。淀粉具有糖基序列和类似阿拉伯半乳糖和AGPs的球形结构。我们对淀粉链上的醛基(St-c)进行修饰，以模拟AGPs上的醛酸残基。此外，还相应地引入钙离子(Ca2+)，以促进水凝胶的固化和增强附着力。然后，在弱碱性环境下，将新型CoSt水凝胶从含有Col-da、St-c和Ca2+的前驱体溶液中凝胶化(图1a)。
图2. 水凝胶粘接性能的显示与表征
水凝胶的粘附性能
将CoSt水凝胶注射到猪肌肉表面后，进一步评估其对组织的粘附能力。经弯曲、扭转、水浸泡和拉伸后，水凝胶保持完整并牢固地附着在组织上(图2)。研究者还观察到，CoSt水凝胶紧紧地附着在湿猪皮上，而不会在强大的水冲洗下掉落。这些结果表明，在体内和动态环境中，水凝胶是一种有效的组织粘合剂。为了进一步量化CoSt水凝胶的湿粘接强度，研究者进行了搭接剪切粘接测试。如图2b-c所示，不同淀粉和胶原含量的CoSt水凝胶在2 h接触时间点的最佳平均粘附强度为62±4.8 kPa，显著高于医用纤维蛋白胶(≈15 kPa)。CoSt水凝胶粘附强度的显著提高，可以归因于CaCO3增强网络的引入，以及胶原蛋白上Ca2+和羧基之间的配位和静电相互作用，以及胶原蛋白和淀粉上酚羟基和亲水性基团之间形成了许多氢键，进一步提高了网络的内聚力和湿润组织。成功去除表面结合的水层对湿组织粘附非常重要因此，我们也验证了新型水凝胶通过快速定量吸收液体来去除界面水的能力。水凝胶表面分别滴加200 μL的水、磷酸缓冲液(PBS)和大鼠全血(1 mL)。所有溶液在10 s内被迅速吸收(图2d)。CoSt水凝胶对液体的快速吸附表明它能够消除界面水的阻隔，从而使水凝胶具有快速的湿表面粘附性。
图3. 水凝胶密封性能的展示与表征
水凝胶的密封性能
为了证明这种新型水凝胶在外科手术中作为缝合线和钉的替代品的潜在应用价值，研究者研究了水凝胶的密封性能。采用大鼠子宫损伤模型直观验证防止液体漏液的效果未治疗组在子宫底部注射蓝色染料，染料从两个切口泄漏，以确认损伤的存在(图3a)。治疗组在注射并封闭CoSt水凝胶后进入其中一个切口，蓝色染料立即被注射到子宫的相同位置(图3b)。在水凝胶修复部位未观察到渗漏，而在对侧切口观察到渗漏。说明CoSt水凝胶能有效地封闭子宫损伤。研究者建立了液体渗漏模型，定量评估水凝胶在体内抵抗液体组织渗漏的能力。该水凝胶被用来密封孔(直径4 mm)在猪膀胱。将损伤的猪膀胱组织置于杯中，倒入10 mL 1.8 wt.%的模拟尿液尿素溶液。然后密封泄漏模型装置，并在一个模拟体内动态过程的激振器。结果发现纤维蛋白胶组在0.5 h内液体几乎全部渗漏。相反，CoSt水凝胶组在前8 h内几乎没有发生泄漏，48 h内只有约3 g的液体泄漏。此外，由于水凝胶胶粘剂在粘附到内脏组织后不可避免地与生物液体接触，其膨胀行为是其关键特性。研究者发现，当CoSt水凝胶浸入PBS(从1到12 h)时，爆裂压力没有随时间发生显著变化。在液体中浸泡12 h后，水凝胶稳定地附着。这些结果表明，在静态和动态环境下，CoSt水凝胶对损伤和泄漏伤口的密封具有持久和稳健的性能。
图4. 水凝胶体外止血效果评价
水凝胶的体外止血及生物相容性研究
体外全血凝固和血细胞黏附常被用来评价止血药物的性能。本实验还对CoSt水凝胶的止血能力进行了评价。凝血指数(BCI)和红细胞分析血小板吸附率。BCI随时间增加而降低，如图4a所示，说明凝血是逐渐发生的。特别是CoSt水凝胶的BCI较纤维蛋白胶和其他对照组最低，说明它能更有效地刺激血液凝固。总体而言，CoSt水凝胶对红细胞和血小板的吸附优于纤维蛋白胶(图4b-c)。此外，研究者评估了凝血与水凝胶接触后血液的速率(图4d)。细胞毒性的检测是止血药物和伤口敷料治疗使用的先决条件，通过L929成纤维细胞LIVE/ DEAD染色和细胞计数kit-8试验研究CoSt水凝胶的细胞相容性作为对照，细胞在纯组织培养板上培养。与CoSt水凝胶共培养7天后，大部分成纤维细胞生长良好，LIVE/DEAD试验表明，在整个培养过程中，几乎没有细胞死亡。CoSt水凝胶的低细胞毒性归因于胶原蛋白固有的高生物相容性和我们的材料中没有有毒成分组件。各组培养的成纤维细胞均表现出良好的增殖倾向。与对照组相比，纤维蛋白组和CoSt水凝胶组分别在3 d和7 d内增殖细胞数量显著增加。结果表明，该水凝胶具有良好的生物相容性。
图5. 水凝胶在大鼠断尾和严重肝损伤模型中的止血性能
水凝胶的体内止血特性
研究者进一步将CoSt水凝胶应用于大鼠断尾、肝切口、肝大缺损、腹主动脉切口、全横断脊髓出血等多种出血模型，验证其在不同出血环境下的体内止血性能。首先，采用大鼠切尾模型进行实验(图5a)。切掉尾巴会对一些组织造成伤害，包括皮肤、骨骼、结缔组织和三根大血管切尾后立即将CoSt水凝胶涂抹在创面，并牢固地粘附在出血的创面上(图5b)。止血在几秒钟内就完成了。图5c为不同治疗情况下5min的定性出血伤口。对照组出血量明显高于实验组，达514.76 ± 70.21 mg，止血时间为4.35 ± 0.19 min(图5d-e)。纤维蛋白胶组出血量减少(178.16 ± 15.41 mg)，止血时间缩短(1.36 ± 0.18 min)(图5d-e)。有趣的是，CoSt水凝胶止血时间仅为0.30 ± 0.15 min，失血量为30.50 ± 13.37 mg(图5d-e)。止血时间和出血量明显减少，表明CoSt水凝胶能有效控制出血。
图6. 水凝胶在大鼠腹主动脉损伤和横断神经损伤模型中的止血性能
研究者进一步建立2 ~ 3 mm大鼠腹主动脉切口模型，进一步评价CoSt水凝胶的止血性能(图6a)。首先，研究者分离腹主动脉，用血管夹夹住两侧。切开切口，取出远端和近端血管夹，未处理的对照组在取出远端血管夹后立即喷血(图6b)。CoSt水凝胶显示出立即有效的止血和密封性能(图6c)。3 min后，创面部位无再次出血，证明制备的材料对腹部动脉损伤有良好的止血效果。此外，即使腹主动脉被拉伸、扭曲、弯曲和浸泡在血液中，CoSt水凝胶也能很好地粘附在腹主动脉上。上述结果表明，CoSt水凝胶能有效控制大鼠严重创伤后大量失血。
小结：综上所述，受贻贝、牡蛎和常春藤粘附机理的启发，研究者设计了CoSt水凝胶作为一种新型的止血生物粘合剂。由于其排水、分子链渗透、交联强化等仿生机理，在各种湿基材料上表现出超高的粘附和密封性能。此外，CaCO3颗粒的动态增强效应、多重可逆动态相互作用(希夫碱反应、氢键、静电力等)使CoSt水凝胶具有适当的机械强度、可重复粘附和自愈合性能。与纤维蛋白胶相比，水凝胶具有更强的组织封闭能力和止血屏障膜的形成。特别地，该CoSt水凝胶可以进一步应用于急诊大出血和非压迫性出血。有趣的是，CoSt水凝胶显示了极大的促进伤口愈合的能力。总的来说，CoSt水凝胶可能是一种有效的无缝合线密封、紧急/非按压止血和不规则伤口愈合的候选者，以应对更复杂的情况。
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