肌腱-骨界面的术后不良愈合是肩袖修复再撕裂的重要原因，近年研究结果显示腱骨愈合是包含骨-软骨-肌腱的非均质多层组织在干细胞与多种促分化因子的时空协同作用下再生的过程。如何在损伤局部区域提供足量干细胞是一个难点，且各类因子在空间定位与持续时间等方面仍存在可控程度低的缺陷。在本研究中，西安交通大学第一附属医院骨科尹战海教授团队与西安交通大学贺健康教授团队合作，采用多通道微挤出细胞打印技术，构建了包含肌腱-纤维软骨-骨三个功能区的多相活性仿生支架，将生物活性因子缓释微球与载细胞生物墨水混合，按照预先设计程序，精确可控打印，实现不同细胞分化因子在支架特定功能层内的精准空间定位，同时将干细胞均匀分布于支架内部。
图1. 生物打印载细胞多相活性仿生支架研究思路图
图2. 载细胞多相活性仿生支架的打印及结构表征。（a）多通道生物打印平台。（b）自制的3通道打印头。（c）激光共聚焦显微镜下观察支架的层特异性结构与支架的大体图片（右上角嵌入图）。（d）红色荧光标记细胞后进行打印，使用光学显微镜与倒置荧光显微镜进行观察。（e）扫描电子显微镜展示支架纤维内部细胞与微球的分布，红色箭头：载生长因子微球，黄色箭头：hUCMSCs细胞。（f）打印后14 d不同区域支架的免疫荧光染色图片。
研究首先通过探索喷头内径、供给流量、平台移动速度等工艺参数对打印凝胶纤维形貌和线宽的影响规律，实现了微米尺度高精度凝胶纤维的稳定打印，并成功打印出载细胞多相活性仿生支架，其网格状结构清晰完整，厚度为279.3 ± 4.3 μm，并可以观察到纤维内部细胞与载因子微球分布均匀，层特异性结构清晰。体外实验证实打印后的hUCMSCs细胞活性良好，且有沿支架纤维定向生长的现象。通过免疫荧光染色与RT-qPCR实验中证实多相活性仿生支架各功能区干细胞有明显的定向的分化趋势。兔肩袖损伤修复实验中，载细胞多相活性仿生支架组在术后组织修复早期，其最大失效载荷迅速达到120.78 ± 30.52 N，这一值甚至高于其他3组在组织修复中后期（术后8w和12w）的最大失效载荷。H&E染色、甲苯胺蓝染色与天狼星红染色进一步证实载细胞多相活性仿生支架可以通过促进肌腱成熟、软骨重塑及胶原纤维排列等作用，显著促进肩袖腱骨界面结构重建。综上所述。采用多通道微挤出细胞打印技术构建的多相活性仿生支架，可以实现因子及细胞在支架内的精确分布，各功能区细胞活性良好，定向分化能力明显，显著促进了肩袖腱骨界面梯度结构的精确重建，为防止肩袖术后再撕裂提供新的解决方案。
图3. 兔肩袖样本术后的胶原纤维与软骨重塑。（a）天狼星红染色图像。（b）胶原纤维的取向统计。（c）甲苯胺蓝染色典型图片。（d）甲苯胺蓝异染区面积统计。B：骨，C：软骨，T：肌腱。*表示P < 0.05。
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